mRNA體外合成解決方案
mRNA疫苗是將含有編碼目標(biāo)蛋白的mRNA片段以特殊的脂質(zhì)膜包裹，注入人體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抗原，以刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。相較于其他傳統(tǒng)疫苗，其具有安全性高、保護(hù)率高、研發(fā)周期短、生產(chǎn)效率高等優(yōu)勢(shì)。mRNA疫苗的成功問(wèn)世加快了RNA療法的發(fā)展，其涉及的mRNA類(lèi)型主要有線(xiàn)性mRNA和circRNA等。
Fig. 1 mRNA疫苗作用機(jī)制[1]
線(xiàn)性mRNA體外合成
線(xiàn)性mRNA療法的關(guān)鍵在于需要在體外高效合成高質(zhì)量的mRNA，再將mRNA通過(guò)遞送系統(tǒng)遞送至人體中。mRNA體外合成離不開(kāi)高質(zhì)量的原料酶。愷佧生物專(zhuān)注于mRNA治療市場(chǎng)，依托獨(dú)有的新型功能重組蛋白和高活性蛋白酶類(lèi)研發(fā)生產(chǎn)平臺(tái)SAMSTM，提供全系列（GMP grade & Research grade）mRNA體外合成所需的的優(yōu)質(zhì)原料酶（Fig. 2）。GMP產(chǎn)品的分析方法經(jīng)系統(tǒng)驗(yàn)證，并進(jìn)行了全方位的QC放行檢測(cè)，滿(mǎn)足了mRNA 疫苗領(lǐng)域?qū)τ谏嫌卧厦傅囊蟆?
Fig. 2 愷佧生物提供的全系列mRNA體外合成原料酶(注:GMP和DMF代表產(chǎn)品為GMP級(jí)別，并完成DMF備案)
01 質(zhì)粒線(xiàn)性化
mRNA體外轉(zhuǎn)錄的模板通常是質(zhì)粒DNA，在轉(zhuǎn)錄前需要對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行線(xiàn)性化處理，線(xiàn)性化可以確保獲得確定長(zhǎng)度及序列的mRNA轉(zhuǎn)錄本。愷佧生物提供BsaI、BspQI、SapI、XbaI等限制性?xún)?nèi)切酶，用于線(xiàn)性化模板的制備。
Fig. 3 BsaI酶切活性檢測(cè)，在20 μl體系加入1 μg質(zhì)粒，1 μl BsaI（1孔為原液，1-11孔依次2倍梯度稀釋?zhuān)盖?0 min，活性≥20 kU/ml。
Fig. 4 BsaI星活性檢測(cè)，在20 μl體系中加入1 μg質(zhì)粒，1 μl BsaI(1孔為原液，1-11孔依次2倍梯度稀釋)，酶切16 h，未見(jiàn)星活性。
02 體外轉(zhuǎn)錄
體外轉(zhuǎn)錄（In Vitro Transcription, IVT）是以線(xiàn)性化質(zhì)粒DNA為模板，在酶的催化作用下，模仿體內(nèi)轉(zhuǎn)錄過(guò)程生成mRNA的技術(shù)。愷佧生物提供GMP級(jí)T7 RNA Polymerase、Premium T7 RNA Polymerase、Inorganic Pyrophosphatase、Murine RNase Inhibitor、DNase I，助力合成高質(zhì)量的mRNA。其中，Premium T7 RNA Polymerase 是對(duì) T7 RNA 聚合酶的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行改造，開(kāi)發(fā)出的一款突變體，可有效降低 IVT 產(chǎn)物中dsRNA的含量，從而降低mRNA的免疫原性。 此外，在共轉(zhuǎn)錄加帽應(yīng)用中，當(dāng) CAP1-Analog 濃度低至1 mM，該酶也可確保較高的加帽率。
Fig. 5 T7 RNA Polymerase轉(zhuǎn)錄效率檢測(cè)，在20 μl體系中，分別以3個(gè)質(zhì)粒（1帶poly A尾，2、3不帶poly A尾）為模板， 37℃下反應(yīng)2 h，轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度分別為2000 nt、4000 nt、2000 nt。T7 RNA Polymerase可高效轉(zhuǎn)錄不同長(zhǎng)度的mRNA。
Fig. 6 探針?lè)z測(cè)T7 RNA Polymerase活性，檢測(cè)原理為當(dāng)探針和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特異性結(jié)合后構(gòu)象改變，熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；分別檢測(cè)三批次的T7 RNA Polymerase，各重復(fù)兩次實(shí)驗(yàn)，其斜率基本一致，三批次的T7 RNA Polymerase活性穩(wěn)定。
Fig. 7 分別使用1st gen T7 RNA Polymerase和Premium T7 RNA Polymerase進(jìn)行共轉(zhuǎn)錄加帽，經(jīng)氯化鋰沉淀純化后分別測(cè)定RNA產(chǎn)量（A）、完整性（B）及dsRNA 含量(C)。結(jié)果顯示，針對(duì)不同的模板，Premium T7 RNA Polymerase均不會(huì)影響RNA的質(zhì)量，并且可有效減少dsRNA的產(chǎn)生。
03 加帽加尾修飾
IVT生成的mRNA的5’端含有三磷酸基團(tuán)，具有很強(qiáng)的免疫原性，在工業(yè)生產(chǎn)中需要對(duì)mRNA進(jìn)行加帽加尾修飾。愷佧生物提供加帽修飾所需的Vaccinia Capping Enzyme和 mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase以及加尾修飾所需的E.coli Poly(A) Polymerase。
LC-MS檢測(cè)Cap1加帽率
Fig. 8 使用愷佧生物Vaccinia Capping Enzyme和mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase對(duì) mRNA 加 Cap1 帽結(jié)構(gòu)，經(jīng) LC-MS 檢測(cè)加帽率為 95.16%。（注：加帽率與酶的性能以及mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素有關(guān)）
circRNA體外合成
將IVT得到的線(xiàn)性mRNA進(jìn)一步環(huán)化即可得到circRNA。環(huán)化方式有I型內(nèi)含子自剪接、II型內(nèi)含子自剪接和T4 RNA Ligase等。愷佧生物提供T4 RNA Ligase 2和RNase R用于體外RNA環(huán)化及circRNA的純化處理，助力circRNA療法的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
Fig. 9 circRNA體外合成
產(chǎn)品列表
| 貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 規(guī)格 | |
| BSA-EE101 | BsaI | 1000 U/5000 U | 立即詢(xún)價(jià) |
| GMP-BSA-EE101 | BsaI(GMP grade) | 20 kU/400 kU | 立即詢(xún)價(jià) |
| BSP-BE101 | BspQI | 1000 U/10 kU | 立即詢(xún)價(jià) |
| SAP-SE101 | SapI | 1000 U/10 kU | 立即詢(xún)價(jià) |
| SAP-SE102 | SapI V2.0 | 1000 U/10 kU | 立即詢(xún)價(jià) |
| XBA-EE101 | XbaI | 2000 U/20 kU | 立即詢(xún)價(jià) |
| T7P-EE101 | T7 RNA Polymerase | 5000 U/25 kU | 立即詢(xún)價(jià) |
| GMP-T7P-EE101 | T7 RNA Polymerase(GMP grade) | 50 kU/1 MU | 立即詢(xún)價(jià) |
| T7P-EE102 | T7 RNA Polymerase Kit | 5000 U/25 kU | 立即詢(xún)價(jià) |
| T7P-EE1MP | Premium T7 RNA Polymerase | 20 kU/100 kU/200 kU | 立即詢(xún)價(jià) |
| GMP-T7P-EE1MP | Premium T7 RNA Polymerase(GMP grade) | 200 kU/2 MU | 立即詢(xún)價(jià) |
| PYR-EE201 | Pyrophosphatase, Inorganic | 10 U/50 U | 立即詢(xún)價(jià) |
| GMP-PYR-YE101 | Pyrophosphatase, Inorganic(GMP grade) | 100 U/800 U | 立即詢(xún)價(jià) |
| RNI-ME001 | Murine RNase Inhibitor | 6000 U/30 kU | 立即詢(xún)價(jià) |
| GMP-RNI-ME101 | Murine RNase Inhibitor(GMP grade) | 120kU /6.6 MU | 立即詢(xún)價(jià) |
| DNI-EE001 | DNase I | 1000 U/5000 U | 立即詢(xún)價(jià) |
| GMP-DNI-EE001 | DNase I(GMP grade) | 4000 U/40 kU | 立即詢(xún)價(jià) |
| VCS-VE101 | Vaccinia Capping Enzyme | 500 U/5000 U | 立即詢(xún)價(jià) |
| GMP-VCS-VE101 | Vaccinia Capping Enzyme(GMP grade) | 10 kU/1 MU | 立即詢(xún)價(jià) |
| MEH-VE101 | mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase | 2500 U/25 kU | 立即詢(xún)價(jià) |
| GMP-MEH-VE101 | mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase(GMP grade) | 50 kU/5 MU | 立即詢(xún)價(jià) |
| PLA-EE101 | E. coli Poly(A) Polymerase | 100 U/500 U | 立即詢(xún)價(jià) |
| TRL-BE104 | T4 RNA Ligase 2 (High Concentration) | 5000 U/50 kU | 立即詢(xún)價(jià) |
| RNR-EE001 | RNase R | 2000 U/20 kU | 立即詢(xún)價(jià) |
[1] Chaudhary, N., Weissman, D. & Whitehead, K.A. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat Rev Drug Discov 20, 817–838 (2021).
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