mRNA體外合成解決方案
mRNA疫苗是將含有編碼目標蛋白的mRNA片段以特殊的脂質(zhì)膜包裹，注入人體細胞內(nèi)產(chǎn)生抗原，以刺激機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。相較于其他傳統(tǒng)疫苗，其具有安全性高、保護率高、研發(fā)周期短、生產(chǎn)效率高等優(yōu)勢。mRNA疫苗的成功問世加快了RNA療法的發(fā)展，其涉及的mRNA類型主要有線性mRNA和circRNA等。
Fig. 1 mRNA疫苗作用機制[1]
線性mRNA體外合成
線性mRNA療法的關(guān)鍵在于需要在體外高效合成高質(zhì)量的mRNA，再將mRNA通過遞送系統(tǒng)遞送至人體中。mRNA體外合成離不開高質(zhì)量的原料酶。愷佧生物專注于mRNA治療市場，依托獨有的新型功能重組蛋白和高活性蛋白酶類研發(fā)生產(chǎn)平臺SAMSTM，提供全系列（GMP grade & Research grade）mRNA體外合成所需的的優(yōu)質(zhì)原料酶（Fig. 2）。GMP產(chǎn)品的分析方法經(jīng)系統(tǒng)驗證，并進行了全方位的QC放行檢測，滿足了mRNA 疫苗領(lǐng)域?qū)τ谏嫌卧厦傅囊蟆?
Fig. 2 愷佧生物提供的全系列mRNA體外合成原料酶(注:GMP和DMF代表產(chǎn)品為GMP級別，并完成DMF備案)
01 質(zhì)粒線性化
mRNA體外轉(zhuǎn)錄的模板通常是質(zhì)粒DNA，在轉(zhuǎn)錄前需要對質(zhì)粒DNA進行線性化處理，線性化可以確保獲得確定長度及序列的mRNA轉(zhuǎn)錄本。愷佧生物提供BsaI、BspQI、SapI、XbaI等限制性內(nèi)切酶，用于線性化模板的制備。
Fig. 3 BsaI酶切活性檢測，在20 μl體系加入1 μg質(zhì)粒，1 μl BsaI（1孔為原液，1-11孔依次2倍梯度稀釋），酶切30 min，活性≥20 kU/ml。
Fig. 4 BsaI星活性檢測，在20 μl體系中加入1 μg質(zhì)粒，1 μl BsaI(1孔為原液，1-11孔依次2倍梯度稀釋)，酶切16 h，未見星活性。
02 體外轉(zhuǎn)錄
體外轉(zhuǎn)錄（In Vitro Transcription, IVT）是以線性化質(zhì)粒DNA為模板，在酶的催化作用下，模仿體內(nèi)轉(zhuǎn)錄過程生成mRNA的技術(shù)。愷佧生物提供GMP級T7 RNA Polymerase、Premium T7 RNA Polymerase、Inorganic Pyrophosphatase、Murine RNase Inhibitor、DNase I，助力合成高質(zhì)量的mRNA。其中，Premium T7 RNA Polymerase 是對 T7 RNA 聚合酶的關(guān)鍵位點進行改造，開發(fā)出的一款突變體，可有效降低 IVT 產(chǎn)物中dsRNA的含量，從而降低mRNA的免疫原性。 此外，在共轉(zhuǎn)錄加帽應(yīng)用中，當 CAP1-Analog 濃度低至1 mM，該酶也可確保較高的加帽率。
Fig. 5 T7 RNA Polymerase轉(zhuǎn)錄效率檢測，在20 μl體系中，分別以3個質(zhì)粒（1帶poly A尾，2、3不帶poly A尾）為模板， 37℃下反應(yīng)2 h，轉(zhuǎn)錄長度分別為2000 nt、4000 nt、2000 nt。T7 RNA Polymerase可高效轉(zhuǎn)錄不同長度的mRNA。
Fig. 6 探針法檢測T7 RNA Polymerase活性，檢測原理為當探針和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特異性結(jié)合后構(gòu)象改變，熒光強度發(fā)生變化；分別檢測三批次的T7 RNA Polymerase，各重復(fù)兩次實驗，其斜率基本一致，三批次的T7 RNA Polymerase活性穩(wěn)定。
Fig. 7 分別使用1st gen T7 RNA Polymerase和Premium T7 RNA Polymerase進行共轉(zhuǎn)錄加帽，經(jīng)氯化鋰沉淀純化后分別測定RNA產(chǎn)量（A）、完整性（B）及dsRNA 含量(C)。結(jié)果顯示，針對不同的模板，Premium T7 RNA Polymerase均不會影響RNA的質(zhì)量，并且可有效減少dsRNA的產(chǎn)生。
03 加帽加尾修飾
IVT生成的mRNA的5’端含有三磷酸基團，具有很強的免疫原性，在工業(yè)生產(chǎn)中需要對mRNA進行加帽加尾修飾。愷佧生物提供加帽修飾所需的Vaccinia Capping Enzyme和 mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase以及加尾修飾所需的E.coliPoly(A) Polymerase。
LC-MS檢測Cap1加帽率
Fig. 8 使用愷佧生物Vaccinia Capping Enzyme和mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase對 mRNA 加 Cap1 帽結(jié)構(gòu)，經(jīng) LC-MS 檢測加帽率為 95.16%。（注：加帽率與酶的性能以及mRNA二級結(jié)構(gòu)等因素有關(guān)）
circRNA體外合成
將IVT得到的線性mRNA進一步環(huán)化即可得到circRNA。環(huán)化方式有I型內(nèi)含子自剪接、II型內(nèi)含子自剪接和T4 RNA Ligase等。愷佧生物提供T4 RNA Ligase 2和RNase R用于體外RNA環(huán)化及circRNA的純化處理，助力circRNA療法的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
Fig. 9 circRNA體外合成
產(chǎn)品列表
| 貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | |
| BSA-EE101 | BsaI | 1000 U/5000 U | 立即詢價 |
| GMP-BSA-EE101 | BsaI(GMP grade) | 20 kU/400 kU | 立即詢價 |
| BSP-BE101 | BspQI | 1000 U/10 kU | 立即詢價 |
| SAP-SE101 | SapI | 1000 U/10 kU | 立即詢價 |
| SAP-SE102 | SapI V2.0 | 1000 U/10 kU | 立即詢價 |
| XBA-EE101 | XbaI | 2000 U/20 kU | 立即詢價 |
| T7P-EE101 | T7 RNA Polymerase | 5000 U/25 kU | 立即詢價 |
| GMP-T7P-EE101 | T7 RNA Polymerase(GMP grade) | 50 kU/1 MU | 立即詢價 |
| T7P-EE102 | T7 RNA Polymerase Kit | 5000 U/25 kU | 立即詢價 |
| T7P-EE1MP | Premium T7 RNA Polymerase | 20 kU/100 kU/200 kU | 立即詢價 |
| GMP-T7P-EE1MP | Premium T7 RNA Polymerase(GMP grade) | 200 kU/2 MU | 立即詢價 |
| PYR-EE201 | Pyrophosphatase, Inorganic | 10 U/50 U | 立即詢價 |
| GMP-PYR-YE101 | Pyrophosphatase, Inorganic(GMP grade) | 100 U/800 U | 立即詢價 |
| RNI-ME001 | Murine RNase Inhibitor | 6000 U/30 kU | 立即詢價 |
| GMP-RNI-ME101 | Murine RNase Inhibitor(GMP grade) | 120kU /6.6 MU | 立即詢價 |
| DNI-EE001 | DNase I | 1000 U/5000 U | 立即詢價 |
| GMP-DNI-EE001 | DNase I(GMP grade) | 4000 U/40 kU | 立即詢價 |
| VCS-VE101 | Vaccinia Capping Enzyme | 500 U/5000 U | 立即詢價 |
| GMP-VCS-VE101 | Vaccinia Capping Enzyme(GMP grade) | 10 kU/1 MU | 立即詢價 |
| MEH-VE101 | mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase | 2500 U/25 kU | 立即詢價 |
| GMP-MEH-VE101 | mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase(GMP grade) | 50 kU/5 MU | 立即詢價 |
| PLA-EE101 | E. coli Poly(A) Polymerase | 100 U/500 U | 立即詢價 |
| TRL-BE104 | T4 RNA Ligase 2 (High Concentration) | 5000 U/50 kU | 立即詢價 |
| RNR-EE001 | RNase R | 2000 U/20 kU | 立即詢價 |
[1] Chaudhary, N., Weissman, D. & Whitehead, K.A. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat Rev Drug Discov 20, 817–838 (2021).
